Metaloenzimas, enzimas, e medicina
Desoxinucleotídeo Biossíntese
Redutases ribonucleótido (RNRs) catalisa um passo essencial na biossíntese do ADN, a conversão de ribonucleótidos a desoxirribonucleótidos. RNR inibição reduz piscinas celulares de desoxinucleotídeos (dNTPs), consequentemente, prejudicando a biossíntese de DNA e reparo do DNA. Esta função crucial tem estimulado o interesse dessas enzimas como antitumoral, antiviral, e alvos de drogas antibacterianas. O laboratório Drennan tem estudado uma grande variedade de enzimas RNR, que podem diferir enormemente na estrutura, estado oligomérico, e regulação. Apesar da sua diversidade, todos os RNRs utilizam um mecanismo conservado que química é iniciada por um radical ligado a proteínas. RNRs são classificados pela forma como eles gera m e armazenar este radical: Classe I RNRs, encontrados em eucariontes, utilizam um ferro e / ou manganês e um co-fator tirosil radical estável; RNRs Classe II, encontrados em bactérias, algas, e archaea, utilizam coenzima B12 (AdoCbl, adenosilcobalamina); RNRs classe III, encontrada em bactérias anaeróbias, utiliza m um cluster Fe4S4 e S-adenosilmetionina para gerar um radical glicil. Estamos usando cristalografia ao analisar todas as três classes de RNRs com o objetivo de compreender a base molecular para substrato e inibidor de ligação, e a regulação alostérica da atividade da enzima.
Trabalhos recentes em laboratórios elucidaram o mecanismo de inibição alostérica na classe Ia RNR a partir de E. coli. Esta enzima é o protótipo para a compreensão da química complexa que todas estas enzimas utilizam para gerar desoxirribonucleótidos. Ao utilizar uma variedade de técnicas em colaboração com os laboratórios de Francisco Asturias da Scripps e Joanne Stubbe no MIT, mostramos que dATP, um produto da reacção RNR, faz com que uma mudança no estado oligomérico de RNR q bloqueia a proteína numa conformação na qual ela não pode realizar a reação.
Oligoméricas mudanças na classe Ia RNR regulam a atividade
Publicações
Ando N, Brignole EJ, Zimanyi CM, Funk MA, Yokoyama K, Asturias FJ, Stubbe J, Drennan CL. (2011) interconvers�s estruturais modular a atividade de Escherichia coli ribonucleótido redutase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 108, 21046-21051.
Sintchak, MD, Arjara, G., Kellogg, BA, Stubbe, J., e Drennan, CL (2002) A estrutura cristalina da Classe II ribonucleotídeo redutase revela como um alostericamente Regulamentado monômero Imita um Dimer, Biologia Nature Structural. 9: 293-300.
Reparo do DNA
O laboratório Drennan está interessado em compreender vários aspectos de reparo de DNA e combinou técnicas estruturais com a bioquímica para entender como as enzimas de reparo do DNA fazem a função. Em colaboração com o laboratório de Leona Samson no MIT, temos resolvido estruturas de uma proteína de reparo do DNA humano, glicosilase DNA alquil (AAG). Para reparar eficientemente o DNA, AAG deve procurar o excesso de milhões de vezes de bases de DNA não modificados para encontrar um punhado de lesões de DNA. Tal pesquisa pode ser facilitada pela capacidade de glicosilase, como AAG, para interagir com o ADN utilizando dois afinidades: uma interação de baixa afinidade num processo de pesquisa, e uma interação de alta afinidade para a reparação catalítica. Nós resolvemos uma estrutura de cristal da proteína de reparação de ADN humano que nos permite investigar, pela primeira vez, uma representação de baixa afinidade deste enzima. Ao combinar essa nova visão com dados bioquímicos e estruturais existentes, somos capazes de considerar a grande questão o de como proteínas de ligação de ADN encontram seus locais de ligação na vasta extensão do genoma.
O mecanismo de reconhecimento e pesquisa de ADN lesão por AAG
O processo conhecido como "resposta adaptativa" E. coli permite a sobrevivência por stress induzido em uma classe de compostos altamente mutagénicos chamados agentes alquilantes de ADN. Quatro proteínas são reguladas positivamente durante a resposta adaptativa, incluindo a proteína de ligação de flavina AIDB, a função das quais é ainda em grande parte desconhecida. Temos trabalhado com o laboratório de Sean Elliott na BU para aplicar uma ampla gama de técnicas d incluindo anisotropia de fluorescência, ultracentrifugação analítica, e cristalografia de raios X para mostrar que a AIDB sofre uma transição de flavina-dependentes em estado de oligomerização a partir de um dímero de um tetrâmero. Estes resultados fornecem evidência forte de que flavina desempenha um papel estrutural na formação de um tetrâmero AIDB, com potenciais implicações funcionais.
AIDB dependente oligomerização da flavina visto por ultracentrifugação
Publicações
Setser JW, Lingaraju GM, Davis CA, Samson LD, Drennan CL. (2012) Procura lesões do ADN: evidências estruturais para a ligação de DNA conformações baixa e mais elevada afinidade de DNA humano glicosilase alquil. Bioquímica 51, 382-390. O texto completo no ACS Publications
Hamill MJ, Jost M, Wong C, Elliott SJ, Drennan CL. (2011) de oligomerização da flavina induzida em resposta adaptativa proteína coli Escherichia AIDB. Biochemistry 50, 10159-10169. O texto completo no ACS Publications
Lingaraju GM, Davis CA, Setser JW, Samson LD, Drennan CL. (2011) base estrutural para a inibição de ADN-glicosilase alquil humana (AAG) por 3, ADN contendo -ethenocytosine N4. J. Biol. Chem. 286, 13205-13213. O texto completo em JBC.org
Vitamina Biossíntese
S-adenosil-metionina (AdoMet) enzimas radicais usam um cluster 4FE-4S para gerar uma espécie de radicais ativos por clivagem redutora de AdoMet. Este radical é um oxidante extraordinário que pode remover um átomo de hidrogénio a partir de um substrato não activado, muitas vezes, iniciando uma cascata de radicais mediada por rearranjos. Os substratos desta superfamília de enzimas variam de pequenas moléculas de proteínas inteiras para moléculas de ADN ou ARN. O laboratório Drennan está atualmente a estudar várias enzimas radicais AdoMet, incluindo aqueles que criam as vitaminas biotinas e lipoate.
A reacção catalisada pelo desafiador da biotina sintase (BIOB)
Publicações
Berkovitch, F., Nicolet, Y., Wan, JT, Jarrett, JT, e Drennan, CL (2004) a estrutura cristalina do Biotina sintase, uma S-adenosilmetionina-Dependent Radical Enzyme, Science. 303: 76-79.
Nicolet, Y., e Drennan, C.L. (2004) AdoMet Radical proteínas - de estrutura para Evolution - Alinhamento de sequências de proteínas divergentes revela Conservação elemento da estrutura secundária Strong, Nucleic Acids Research. 32: 4015-4025.
Biossíntese de Produtos Naturais
Enzimas de ferro não-heme aproveitam o oxigênio para executar uma ampla variedade de química desafiadora, incluindo a hidroxilação, epoxidação, e halogenação. Estas enzimas são muitas vezes utilizadas para realizar as reações na biossíntese de produto natural. Por exemplo, o ácido epoxidase hydroxypropylphosphonic (HPPE) realiza uma reação de epoxidação chave na biossíntese do antibiótico fosfomicina. Em colaboração com o laboratório de Ben Liu, que cristalizaram a enzima ligada a vários substratos artificiais. Usando esta informação estrutural, que revelaram uma imagem clara do mecanismo e a base estrutural para a especificidade do substrato.
HPPE formação catalisada de fosfomicina
Substratos ligados a HPPE revelam A especificidade de substrato
Um grande número de produtos naturais são sintetizados a partir de materiais de partida conhecidos, por exemplo, aminoácidos. Esses blocos de construção iniciais são muitas vezes modificados para alterar a sua reatividade ou permitir que eles se ligam aos seus alvos. O laboratório Drennan está interessado na "costura" e as enzimas que geram estes aminoácidos modificados, a maioria dos quais são importantes para a atividade dos produtos naturais que fazem parte da enzima SyrB2 no ferro já que o heme catalisa uma reação de halogenação, que é essencial para a atividade de syringomycin, um agente anti-fúngico. Estamos interessados em compreender como a estrutura de enzimas como SyrB2 sintoniza a sua função e especificidade.
A reação de halogenação catalisada por SyrB2
Publicações
Yun D, Dey M, Higgins LJ, Yan F, Liu HW, Drennan CL. (2011) base estrutural da regioespecificidade de um ferro Enzyme Mononuclear em Antibiótico Fosfomicina Biossíntese. Geléia. Chem. Soe. 131, 11.262-11.269.
Blasiak LC, Vaillancourt FH, Walsh CT, e Drennan CL. (2006) A estrutura de cristal da não-heme halogenase ferro SyrB2 na biossíntese syringomycin, Nature. 440: 368-71.
Higgins LJ, Yan F, P Liu, Liu HW, e Drennan CL. (2005) visão estrutural na biossíntese de antibiótico fosfomicina por uma enzima ferro mononuclear, Nature. 437L838-44.
Flavoenzymes conter um FAD ou FMN cofator e são capazes de executar algumas das mesmas reações químicas catalisadas por enzimas complexas de ferro do heme e mononucleares. O laboratório Drennan está interessado em vários flavoenzymes envolvidos na biossíntese de produtos naturais, incluindo indolocarbazole rebecamicina e estaurosporina. O andaime destas moléculas complexas é construído pela enzima RebC através da oxidação de dois resíduos triptofano. O halogenase RebH dependente de FAD executa uma cloração do triptofano durante a produção de rebecamicina. Esta reação é particularmente interessante em comparação com a catalisada por halogenação do SyrB2 enzima de ferro não-heme, como descrito acima. O laboratório Drennan está trabalhando em estreita colaboração com o laboratório ofChristopher Walsh na Harvard Medical School para compreender o mecanismo destas enzimas: como eles são semelhantes, como as enzimas controlam os intermediários reativos, e como a especificidade do substrato é controlada.
Rebecamicina quimioterapêutico e o halogenase RebH
Publicações
Ryan KS, Chakraborty S, Howard-Jones AR, Walsh CT, Ballou DP, Drennan CL. (2008) O FAD Cofactor de RebC Desloca para uma conformação sobre Redução Flavin. Biochemistry.47: 14506-13513.
Ryan KS, Howard-Jones AR, Hamill MJ, Elliott SJ, Walsh CT, Drennan CL. (2007) cristalográfica prendendo na enzima biossintética rebecamicina RebC. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (39): 15311-15316.
Yeh E, Blasiak LC, Koglin A, Drennan CL, Walsh CT. (2007) A cloração por um intermediário de longa vida no mecanismo de halogenases dependente da flavina, Biochemistry. 46: 1284-1292.
Desoxinucleotídeo Biossíntese
Redutases ribonucleótido (RNRs) catalisa um passo essencial na biossíntese do ADN, a conversão de ribonucleótidos a desoxirribonucleótidos. RNR inibição reduz piscinas celulares de desoxinucleotídeos (dNTPs), consequentemente, prejudicando a biossíntese de DNA e reparo do DNA. Esta função crucial tem estimulado o interesse dessas enzimas como antitumoral, antiviral, e alvos de drogas antibacterianas. O laboratório Drennan tem estudado uma grande variedade de enzimas RNR, que podem diferir enormemente na estrutura, estado oligomérico, e regulação. Apesar da sua diversidade, todos os RNRs utilizam um mecanismo conservado que química é iniciada por um radical ligado a proteínas. RNRs são classificados pela forma como eles gera m e armazenar este radical: Classe I RNRs, encontrados em eucariontes, utilizam um ferro e / ou manganês e um co-fator tirosil radical estável; RNRs Classe II, encontrados em bactérias, algas, e archaea, utilizam coenzima B12 (AdoCbl, adenosilcobalamina); RNRs classe III, encontrada em bactérias anaeróbias, utiliza m um cluster Fe4S4 e S-adenosilmetionina para gerar um radical glicil. Estamos usando cristalografia ao analisar todas as três classes de RNRs com o objetivo de compreender a base molecular para substrato e inibidor de ligação, e a regulação alostérica da atividade da enzima.
Trabalhos recentes em laboratórios elucidaram o mecanismo de inibição alostérica na classe Ia RNR a partir de E. coli. Esta enzima é o protótipo para a compreensão da química complexa que todas estas enzimas utilizam para gerar desoxirribonucleótidos. Ao utilizar uma variedade de técnicas em colaboração com os laboratórios de Francisco Asturias da Scripps e Joanne Stubbe no MIT, mostramos que dATP, um produto da reacção RNR, faz com que uma mudança no estado oligomérico de RNR q bloqueia a proteína numa conformação na qual ela não pode realizar a reação.
Oligoméricas mudanças na classe Ia RNR regulam a atividade
Publicações
Ando N, Brignole EJ, Zimanyi CM, Funk MA, Yokoyama K, Asturias FJ, Stubbe J, Drennan CL. (2011) interconvers�s estruturais modular a atividade de Escherichia coli ribonucleótido redutase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 108, 21046-21051.
Sintchak, MD, Arjara, G., Kellogg, BA, Stubbe, J., e Drennan, CL (2002) A estrutura cristalina da Classe II ribonucleotídeo redutase revela como um alostericamente Regulamentado monômero Imita um Dimer, Biologia Nature Structural. 9: 293-300.
Reparo do DNA
O laboratório Drennan está interessado em compreender vários aspectos de reparo de DNA e combinou técnicas estruturais com a bioquímica para entender como as enzimas de reparo do DNA fazem a função. Em colaboração com o laboratório de Leona Samson no MIT, temos resolvido estruturas de uma proteína de reparo do DNA humano, glicosilase DNA alquil (AAG). Para reparar eficientemente o DNA, AAG deve procurar o excesso de milhões de vezes de bases de DNA não modificados para encontrar um punhado de lesões de DNA. Tal pesquisa pode ser facilitada pela capacidade de glicosilase, como AAG, para interagir com o ADN utilizando dois afinidades: uma interação de baixa afinidade num processo de pesquisa, e uma interação de alta afinidade para a reparação catalítica. Nós resolvemos uma estrutura de cristal da proteína de reparação de ADN humano que nos permite investigar, pela primeira vez, uma representação de baixa afinidade deste enzima. Ao combinar essa nova visão com dados bioquímicos e estruturais existentes, somos capazes de considerar a grande questão o de como proteínas de ligação de ADN encontram seus locais de ligação na vasta extensão do genoma.
O mecanismo de reconhecimento e pesquisa de ADN lesão por AAG
O processo conhecido como "resposta adaptativa" E. coli permite a sobrevivência por stress induzido em uma classe de compostos altamente mutagénicos chamados agentes alquilantes de ADN. Quatro proteínas são reguladas positivamente durante a resposta adaptativa, incluindo a proteína de ligação de flavina AIDB, a função das quais é ainda em grande parte desconhecida. Temos trabalhado com o laboratório de Sean Elliott na BU para aplicar uma ampla gama de técnicas d incluindo anisotropia de fluorescência, ultracentrifugação analítica, e cristalografia de raios X para mostrar que a AIDB sofre uma transição de flavina-dependentes em estado de oligomerização a partir de um dímero de um tetrâmero. Estes resultados fornecem evidência forte de que flavina desempenha um papel estrutural na formação de um tetrâmero AIDB, com potenciais implicações funcionais.
AIDB dependente oligomerização da flavina visto por ultracentrifugação
Publicações
Setser JW, Lingaraju GM, Davis CA, Samson LD, Drennan CL. (2012) Procura lesões do ADN: evidências estruturais para a ligação de DNA conformações baixa e mais elevada afinidade de DNA humano glicosilase alquil. Bioquímica 51, 382-390. O texto completo no ACS Publications
Hamill MJ, Jost M, Wong C, Elliott SJ, Drennan CL. (2011) de oligomerização da flavina induzida em resposta adaptativa proteína coli Escherichia AIDB. Biochemistry 50, 10159-10169. O texto completo no ACS Publications
Lingaraju GM, Davis CA, Setser JW, Samson LD, Drennan CL. (2011) base estrutural para a inibição de ADN-glicosilase alquil humana (AAG) por 3, ADN contendo -ethenocytosine N4. J. Biol. Chem. 286, 13205-13213. O texto completo em JBC.org
Vitamina Biossíntese
S-adenosil-metionina (AdoMet) enzimas radicais usam um cluster 4FE-4S para gerar uma espécie de radicais ativos por clivagem redutora de AdoMet. Este radical é um oxidante extraordinário que pode remover um átomo de hidrogénio a partir de um substrato não activado, muitas vezes, iniciando uma cascata de radicais mediada por rearranjos. Os substratos desta superfamília de enzimas variam de pequenas moléculas de proteínas inteiras para moléculas de ADN ou ARN. O laboratório Drennan está atualmente a estudar várias enzimas radicais AdoMet, incluindo aqueles que criam as vitaminas biotinas e lipoate.
A reacção catalisada pelo desafiador da biotina sintase (BIOB)
Publicações
Berkovitch, F., Nicolet, Y., Wan, JT, Jarrett, JT, e Drennan, CL (2004) a estrutura cristalina do Biotina sintase, uma S-adenosilmetionina-Dependent Radical Enzyme, Science. 303: 76-79.
Nicolet, Y., e Drennan, C.L. (2004) AdoMet Radical proteínas - de estrutura para Evolution - Alinhamento de sequências de proteínas divergentes revela Conservação elemento da estrutura secundária Strong, Nucleic Acids Research. 32: 4015-4025.
Biossíntese de Produtos Naturais
Enzimas de ferro não-heme aproveitam o oxigênio para executar uma ampla variedade de química desafiadora, incluindo a hidroxilação, epoxidação, e halogenação. Estas enzimas são muitas vezes utilizadas para realizar as reações na biossíntese de produto natural. Por exemplo, o ácido epoxidase hydroxypropylphosphonic (HPPE) realiza uma reação de epoxidação chave na biossíntese do antibiótico fosfomicina. Em colaboração com o laboratório de Ben Liu, que cristalizaram a enzima ligada a vários substratos artificiais. Usando esta informação estrutural, que revelaram uma imagem clara do mecanismo e a base estrutural para a especificidade do substrato.
HPPE formação catalisada de fosfomicina
Substratos ligados a HPPE revelam A especificidade de substrato
Um grande número de produtos naturais são sintetizados a partir de materiais de partida conhecidos, por exemplo, aminoácidos. Esses blocos de construção iniciais são muitas vezes modificados para alterar a sua reatividade ou permitir que eles se ligam aos seus alvos. O laboratório Drennan está interessado na "costura" e as enzimas que geram estes aminoácidos modificados, a maioria dos quais são importantes para a atividade dos produtos naturais que fazem parte da enzima SyrB2 no ferro já que o heme catalisa uma reação de halogenação, que é essencial para a atividade de syringomycin, um agente anti-fúngico. Estamos interessados em compreender como a estrutura de enzimas como SyrB2 sintoniza a sua função e especificidade.
A reação de halogenação catalisada por SyrB2
Publicações
Yun D, Dey M, Higgins LJ, Yan F, Liu HW, Drennan CL. (2011) base estrutural da regioespecificidade de um ferro Enzyme Mononuclear em Antibiótico Fosfomicina Biossíntese. Geléia. Chem. Soe. 131, 11.262-11.269.
Blasiak LC, Vaillancourt FH, Walsh CT, e Drennan CL. (2006) A estrutura de cristal da não-heme halogenase ferro SyrB2 na biossíntese syringomycin, Nature. 440: 368-71.
Higgins LJ, Yan F, P Liu, Liu HW, e Drennan CL. (2005) visão estrutural na biossíntese de antibiótico fosfomicina por uma enzima ferro mononuclear, Nature. 437L838-44.
Flavoenzymes conter um FAD ou FMN cofator e são capazes de executar algumas das mesmas reações químicas catalisadas por enzimas complexas de ferro do heme e mononucleares. O laboratório Drennan está interessado em vários flavoenzymes envolvidos na biossíntese de produtos naturais, incluindo indolocarbazole rebecamicina e estaurosporina. O andaime destas moléculas complexas é construído pela enzima RebC através da oxidação de dois resíduos triptofano. O halogenase RebH dependente de FAD executa uma cloração do triptofano durante a produção de rebecamicina. Esta reação é particularmente interessante em comparação com a catalisada por halogenação do SyrB2 enzima de ferro não-heme, como descrito acima. O laboratório Drennan está trabalhando em estreita colaboração com o laboratório ofChristopher Walsh na Harvard Medical School para compreender o mecanismo destas enzimas: como eles são semelhantes, como as enzimas controlam os intermediários reativos, e como a especificidade do substrato é controlada.
Rebecamicina quimioterapêutico e o halogenase RebH
Publicações
Ryan KS, Chakraborty S, Howard-Jones AR, Walsh CT, Ballou DP, Drennan CL. (2008) O FAD Cofactor de RebC Desloca para uma conformação sobre Redução Flavin. Biochemistry.47: 14506-13513.
Ryan KS, Howard-Jones AR, Hamill MJ, Elliott SJ, Walsh CT, Drennan CL. (2007) cristalográfica prendendo na enzima biossintética rebecamicina RebC. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (39): 15311-15316.
Yeh E, Blasiak LC, Koglin A, Drennan CL, Walsh CT. (2007) A cloração por um intermediário de longa vida no mecanismo de halogenases dependente da flavina, Biochemistry. 46: 1284-1292.